非洲綠猴腎細胞是從正常成年非洲綠猴的腎臟組織中分離建立的。該細胞常作為轉染宿主,用于支原體的檢測。細胞在培養瓶中培養至狀態良好后灌滿培養基運輸,獲得細胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒,然后在超凈臺中操作;如細胞生長至70%-80%,將瓶中的培養基移入無菌瓶中留作培養使用,保留5-8mL培養基在37℃、5%的CO2的溫箱中繼續培養。細胞培養至90%-100%后,按要求消化傳代;棄去培養基,用無菌PBS或者其他緩沖液清洗細胞2次,加入適量胰蛋白酶消化(EDTA胰酶),待細胞*脫壁后加培養基吹打混勻,分瓶培養。
非洲綠猴腎細胞Vero可能作為表達外源蛋白質的有用細胞。作為一種連續傳代的靈長類細胞,Vero細胞的糖基化酶可能與人類的相似。Vero細胞可以大規模培養,已經用于脊髓灰質炎病毒疫苗的生產。研究了不同條件下Vero細胞的轉染效率,包括脂質體和DNA的濃度,細胞數量以及細胞暴露于脂質體-DNA混合物中的時間。通過檢測報告基因β-gal確定轉染效率,優化不同轉染參數,提高了Vero細胞脂質體轉染的效率和表達水平。
非洲綠猴腎細胞進行細胞傳染的步驟:
(1)在24孔細胞培養板中,以2.5~7.5×10°細胞/孔接種細胞于0.5ml適當*培養基中。
(2)37℃過夜培養細胞,直到細胞生長至50~80%匯和。
(3)在滅菌的Eppendorf管中準備下列溶液
溶液A:用25u1無血清培養基稀釋0.25~0.5ug pCDNA3LacZ。
溶液B:用25ul無血清培養基稀釋0.5~6.25ul lipofectAMINE試劑。
(4)溫和混合兩溶液,室溫放置15~45分鐘以利于DNA-脂質體復合物的形成,與此同時,用0.5ml無血清培養基沖洗細胞一次。
(5)混合物中加入0.2ml無血清培養基,溫和混合,加入到漂洗過的細胞中。
(6)37℃二氧化碳溫箱溫育2~24小時。
(7)溫育結束后,不清除轉染混合物直接加入含兩倍濃度血清的培養基。
(8)轉染18~24小時后,換以新鮮的*培養基。
(9)48小時后,收獲細胞或開始篩選。