--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱： HL-60(人原髓細胞白血病細胞)

細胞別稱： HL 60; HL60

細胞貨號： SNL-040

生長特性： 懸浮

培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡介： HL-60細胞是源自一位患有急性粒-單核細胞白血病的36歲白人女性的早幼粒細胞系。HL-60細胞自發(fā)分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇、肉豆蔻酸、DMSO(1%-1.5%)、放線菌素D和視黃酸均可以促進分化。HL-60細胞表現出吞噬活性，并對趨化刺激有響應；HL-60細胞致癌基因myc表達陽性。該細胞系可用于免疫紊亂和免疫學研究。

細胞正常生長形態(tài)照片

HL-60細胞培養(yǎng)注意事項

l HL-60細胞懸浮圓形生長，偶有小聚團，屬于正常現象，無需吹散；

l 少量細胞附著瓶底屬于正常現象，可將懸浮細胞轉移至新瓶，丟棄貼壁的細胞；

l 圓形透亮、細胞膜完整的細胞是活細胞，如果無法判斷，可以取少量細胞用臺盼藍染色后計數確定細胞活率；

l 接種密度建議在10萬-50萬細胞/mL之間為宜，密度過低或過高都可能造成細胞狀態(tài)變差；

l 復蘇時需盡快離心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60細胞發(fā)生分化；

l HL-60細胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境，不頻繁拿出培養(yǎng)箱，不頻繁離心；

l 當細胞狀態(tài)較差時，不建議對細胞進行離心，需換液時可采用半換液法（詳細步驟見下文）

HL-60細胞換液方法

l 半換液法：

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間，待細胞沉底；（肉眼觀察細胞沉底情況）

3. 小心吸出一半的培養(yǎng)基，轉移到離心管；

4. 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；

5. 原瓶補充一半的新鮮培養(yǎng)基，混勻細胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

l 離心換液法：

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

2. 將所有細胞懸液轉移至離心管中；

3. 900-1000rpm，3min離心；

4. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

5. 離心完成后棄上清，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀，將細胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中，混勻細胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

HL-60細胞傳代方法

l 離心法：

1.取少量細胞懸液進行計數確定細胞密度，密度80萬/mL以上傳代，并根據計數結果確定傳代比例；

2.準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

3.用移液器吸取培養(yǎng)瓶內細胞懸液轉移至離心管中；

4.900-1000rpm，3min離心收集細胞；

5.在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

6.離心完成后，棄離心管內上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：懸浮細胞通常都偏脆弱，注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉速以及時間不要過高，避免細胞受機械損傷。

l 直接分瓶法：

1. 取少量細胞懸液進行計數確定細胞密度，密度80萬/mL以上傳代，并根據計數結果確定傳代比例；

2. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分散；

3. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內細胞懸液，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補充適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：用直接分瓶法傳代1-2次后需進行離心傳代。

HL-60細胞凍存方法

1. 取少量細胞懸液進行計數確認細胞密度。

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右，待細胞活力穩(wěn)定后再進行凍存。

2. 準備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預熱）

3. 根據收集到細胞量，配制相應量的凍存液，并準備相應數量的凍存管，在凍存管上標志細胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO；凍存密度200-300萬細胞/mL/管。

Tips：凍存密度過低將導致復蘇后狀態(tài)不佳。

4. 將細胞懸液轉移至離心管中1000rpm，3min離心收集細胞；

5. 離心完成后棄上清，加入相應量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細胞，將細胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產生過多氣泡；

Tips：加入凍存液混勻細胞后及時分裝并將細胞降溫凍存，以減少DMSO對細胞的毒性。

6. 將細胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉移至-80℃冰箱進行降溫凍存。

7. 次日復蘇一管檢查凍存效果，確認沒問題后及時將凍存細胞放置液氮中保存，細胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

HL-60細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將凍存細胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完*融化，融化時間1min左右；

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；

4. 離心完成后棄上清，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，吹散細胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

5. 使用十字法或8字法將細胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：

1. 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

2. 細胞融化后需盡快離心去除DMSO，避免DMSO刺激HL-60細胞發(fā)生分化。

3. 整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。

HL-60細胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒，確認細胞，說明書等是否齊全，收貨細胞名與所購買細胞是否符合；

2. 觀察細胞培養(yǎng)瓶是否完好，有無漏液，培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現異常及時拍照聯系銷售人員；

3. 確認無異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右，讓懸浮細胞沉下培養(yǎng)瓶底部；

4. 平衡過程中可以仔細閱讀細胞說明書，知悉細胞所需培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等；

5. 平衡完成后豎立取出細胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細胞沉在培養(yǎng)瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細胞；

6. 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細胞，上清可以4℃保存，后續(xù)用于培養(yǎng)細胞，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細胞接種至原培養(yǎng)瓶；

7. 輕輕混勻細胞，取100-200ul細胞懸液進行計數，根據計數結果調整細胞培養(yǎng)密度。然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

常見問題及解決方案

1.細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細胞生長，不建議頻繁離心。

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